蛋白質被泛素-蛋白酶體系統降解需經過以下過程：①靶蛋白的泛素化；②靶蛋白的降解。三種重要的酶共同介導了靶蛋白泛素化過程：泛素活化酶（ubiquitin activating enzyme，E1）、泛素結合酶（ubiquitin conjugating enzyme，E2）和泛素連接酶（ubiquitin-protein ligase，E3）。E1水解ATP后與泛素分子C端形成硫酯鍵，然后E1將活化的泛素遞交給E2，最后泛素在E3的募集作用下，從E2轉移到靶蛋白上，或者靶蛋白首先與E3結合，泛素再轉移過來。泛素化的靶蛋白最終進入26S蛋白酶體而被降解，而泛素分子則從泛素鏈中分離開來，從而實現重復利用。關于E1的作用機制及具體數目尚不明確，在人類組織中至少已發現了40多種E2及700多種E3。且E3具有高度的底物特異性，通過識別和結合特異的靶蛋白序列或降解決定子（degron），即N末端法則實現對靶蛋白的選擇性降解。
泛素一蛋白酶體途徑（ubiquitin-proteasome pathway）是細胞內一個重要的蛋白質降解調節系統。通過對底物蛋白的多聚泛素化并經蛋白酶體降解，可以影響或調節多種細胞活動，包括：基因轉錄、細胞周期調節、免疫反應、細胞受體功能及腫瘤生長、炎癥過程等。該途徑也是一種動態的蛋白質雙向修飾調控系統，在體內由泛素連接酶系統（E1-E2-E3）對底物進行泛素化修飾，去泛素化酶（DUB）家族負責通過水解泛素羧基末端的酯鍵、肽鍵或異肽鍵，將泛素分子特異性的從鏈接有泛素的蛋白質或者前體蛋白水解下來，起到去泛素化的作用，對蛋白降解進行反向調節，從而影響蛋白質的功能。
去泛素化酶是一類數量很大的蛋白酶家族，主要分為五個家族，分別是泛素羧基末端水解酶（UCH）家族，泛素特異性蛋白酶（USP/UBP）家族，Otubaim（OTU）家族，Josephin結構域蛋白家族及JAMM家族。
在細胞內去泛素化酶的功能可大致分為以下幾種: (1)加工泛素前體, 產生自由的泛素分子; (2)移除蛋白質上的泛素鏈, 避免蛋白質被蛋白酶體降解, 從而穩定蛋白質; (3) 移除蛋白質上連接的非降解泛素化信號; (4)通過阻 止泛素分子與底物蛋白質一起被降解, 確保細胞內泛素分子的穩態; (5)參與細胞內游離泛素鏈的解體; (6)通過剪切泛素鏈, 編輯泛素鏈的類型。
去泛素化酶（Deubiquitinating enzymes, DUB）：與泛素化修飾需要E1、E2及E3三種酶共同作用不同，去泛素化的過程只需要DUBs，且DUBs作用的底物蛋白是被泛素修飾的蛋白（圖1）。DUBs通過水解泛素分子羧基末端的肽鍵、異肽鍵或酯鍵從而去除底物蛋白中的泛素或通過縮短共軛泛素鏈來抵消泛素化，進而抑制底物蛋白的降解(Vogel K and Isono E., 2024)。
圖1 泛素化和去泛素化過程(Zheng et al., 2023)。泛素化過程由E1泛素活化酶、E2泛素偶聯酶和E3泛素連接酶完成。E1酶激活泛素并將其轉移到E2酶。然后，E2酶與E3酶相互作用，導致泛素從E2酶轉移到特定的靶蛋白。泛素化蛋白可以被蛋白酶體識別和降解。泛素化可以通過去泛素化逆轉，去泛素化是一種將泛素從靶蛋白中分離出來的過程。
去泛素化酶的分類
在真核生物中，根據催化機制的不同，DUBs可分為兩大類：半胱氨酸蛋白酶家族和金屬蛋白酶家族（圖2）。其中，半胱氨酸蛋白酶家族包括泛素特異性蛋白酶（USPs）、泛素C端水解酶（UCHs）、Machado?Joseph結構域蛋白酶（MJDs）、卵巢腫瘤蛋白酶（OUTs）、Motif與泛素分子結合的DUB家族蛋白酶（MINDYs）和含鋅指泛素肽酶（ZUP/ZUFSP）六類；而金屬蛋白酶家族只包含MPN(+)/JAMM蛋白酶家族(Clague et al., 2019)。根據當前已有的DUBs研究結果， Vogel K和Isono E兩位研究者統計了擬南芥中DUBs的種類及其對應的結構域（圖3）。
圖2 特異性DUBs的催化機制(Vogel K and Isono E., 2024)。（A）以泛素二聚體為底物的半胱氨酸蛋白酶DUBs的催化機制。S1位點結合末端或遠端泛素（UB環），而S1'位點結合近端泛素，該泛素有一個游離的C端或與靶蛋白結合。這些結合位點有助于將遠端泛素的C端甘氨酸（G）和近端泛素的賴氨酸（K）之間的異肽鍵定位在活性位點附近。活性位點三聯體由半胱氨酸（C）、組氨酸（H）和天冬氨酸（D）組成。在第一步中，半胱氨酸側鏈的硫陰離子在異肽鍵的親電碳原子上發生親核攻擊。半胱氨酸側鏈的硫陰離子被質子化組氨酸側鏈穩定，而組氨酸側鏈又被天冬氨酸側鏈穩定。親核攻擊后，催化位點半胱氨酸的硫原子與異肽鍵的碳原子之間形成臨時鍵，導致異肽鍵斷裂，近端泛素釋放。親電的碳原子是硫酯鍵的一部分，可以被來自水分子的親核氧攻擊。隨后，來自水的羥基與遠端泛素的C端甘氨酸的碳原子結合，將遠端泛素從催化側移除。催化位點組氨酸被來自水分子的第二個質子質子化；（B）金屬蛋白酶DUBs的催化機理。遠端泛素和近端泛素分別與S1和S1'位點結合，使異肽鍵靠近活性位點。活性位點包括一個絲氨酸（S）、一個天冬氨酸（D）、兩個組氨酸（H）、一個谷氨酸（E）和一個由組氨酸和天冬氨酸配位的鋅質子（Zn2+）。在泛素結合之前，活性位點的鋅質子與水分子發生反應，這使得水分子處于活性中心，允許它的1個質子與谷氨酸側鏈上帶負電的氧原子結合，進而形成一個帶負電荷的羥基，這個羥基此時處于攻擊異肽鍵的親電碳的最佳位置。當與泛素結合時，來自異肽鍵的親電碳受到來自水的親核氧的攻擊，該反應通過活性位點絲氨酸對異肽鍵羰基氧原子的暫時穩定促進。水的親核攻擊引起異肽鍵的水解，導致遠端和近端泛素的釋放。遠端泛素的C末端甘氨酸與來自水分子的羥基結合，而近端泛素賴氨酸側鏈的氨基則與來自水分子的質子結合。參與反應的側鏈官能團用骨架式表示，共價鍵用黑色實線表示，非共價鍵用黑色虛線表示。
圖3 擬南芥DUBs的種類及結構域(Vogel K and Isono E., 2024)。
UbiQBio成立于2010年,位于荷蘭阿姆斯特丹,專注于泛素(ubiquitin)及其類似蛋白的研究工具開發。公司由教授Huib Ovaa、Farid El Oualid和Alfred Nijkerk創立,致力于為藥物發現。技術平臺由三項專有技術組成: Ubi0Bl0ckm.Ubi0-Cick" 和 Ubi0-Swn™，這使我們能夠開發泛素 (Ub)領域所缺乏的產品和服務，利用這些化學合成技術，我們可以構建件何U6綴合物、Ub突變體及其組合。現在可以更有效地開發已知試劑，但最重要的是構建遠遠超出任何當前可用(生物)方法所能達到的試劑。借助我們的專有技術平臺，我們能夠使用自動同相肽合成技術合成天然構象的位點選擇性泛素化肽。
