哺乳動(dòng)物細(xì)胞組織培養(yǎng)技術(shù)指南。涵蓋大量關(guān)于哺乳動(dòng)物細(xì)胞系的維持、分裂和細(xì)胞保存的信息。請(qǐng)注意，所有細(xì)胞培養(yǎng)必須使用無菌技術(shù)在層流罩中進(jìn)行。

細(xì)胞培養(yǎng)是細(xì)胞和分子生物學(xué)中使用的關(guān)鍵工具，可以對(duì)細(xì)胞的生理學(xué)和生物化學(xué)進(jìn)行建模。此外，細(xì)胞培養(yǎng)使研究人員能夠確定藥物和有毒化合物對(duì)細(xì)胞反應(yīng)的影響。由于使用一批克隆細(xì)胞可獲得一致和可重復(fù)的結(jié)果，細(xì)胞培養(yǎng)仍然是當(dāng)今研究中使用*泛的技術(shù)之一。

來自動(dòng)物或植物的細(xì)胞在有利環(huán)境中的生長(zhǎng)被稱為細(xì)胞培養(yǎng)。不同的細(xì)胞有不同的培養(yǎng)要求，為了達(dá)到最佳的生長(zhǎng)效果，可以通過培養(yǎng)基的選擇和補(bǔ)充劑來滿足。所用介質(zhì)的作用是提供必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)（氨基酸、碳水化合物、維生素、礦物質(zhì)）、生長(zhǎng)因子、激素、氣體（O2、 CO2），并調(diào)節(jié)物理化學(xué)環(huán)境（pH值、滲透壓、溫度）。

原代培養(yǎng)是指在組織分離后直接進(jìn)行培養(yǎng)的細(xì)胞。一旦這些細(xì)胞匯合，即會(huì)占據(jù)燒瓶中所有可用空間，此時(shí)就需要將它們轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的生長(zhǎng)容器中進(jìn)行傳代或分割，這將為細(xì)胞提供更多的繼續(xù)生長(zhǎng)和擴(kuò)展的空間。第一次傳代后，原代培養(yǎng)現(xiàn)在成為所謂的細(xì)胞系。源自原代培養(yǎng)的細(xì)胞系壽命有限，這意味著它們?cè)谒ダ现爸荒芊至延邢薜拇螖?shù)。

由于細(xì)胞被傳代，生長(zhǎng)能力*的細(xì)胞占優(yōu)勢(shì)，導(dǎo)致群體的基因型和表型一致。永生細(xì)胞系廣泛用于細(xì)胞和分子生物學(xué)，以繞過衰老等問題。細(xì)胞可以通過多種不同方式轉(zhuǎn)化并永生。自發(fā)地、化學(xué)地或病毒地。一旦轉(zhuǎn)化，這些細(xì)胞就獲得了無限分裂的能力，成為一個(gè)連續(xù)的細(xì)胞系。

細(xì)胞系可以是：

1.貼壁（貼壁依賴性）——貼壁細(xì)胞必須在附著于固體或半固體底物上時(shí)進(jìn)行培養(yǎng)，通常需要胰蛋白酶法進(jìn)行亞培養(yǎng)（更多信息請(qǐng)參見2.6）。

2.懸浮（與錨固無關(guān)）——懸浮細(xì)胞不需要固體生長(zhǎng)底物，可以懸浮在培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。

以下是細(xì)胞系培養(yǎng)的通用指南。所有細(xì)胞培養(yǎng)必須在微生物安全柜中進(jìn)行，使用無菌技術(shù)確保無菌。研究人員必須全程穿著防護(hù)服。

良好的無菌技術(shù)旨在創(chuàng)建無菌環(huán)境，并充當(dāng)微生物與無菌細(xì)胞培養(yǎng)罩之間的屏障。該技術(shù)的關(guān)鍵包括使用無菌試劑和培養(yǎng)基。無菌操作確保未經(jīng)過70%乙醇噴灑過的任何物體進(jìn)入罩內(nèi)。

層流罩制備

細(xì)胞培養(yǎng)罩可提供無菌工作區(qū)，同時(shí)可確?？刂莆⑸锍绦虍a(chǎn)生的任何傳染性飛濺物或氣溶膠。細(xì)胞培養(yǎng)罩有3種類型，分別為I級(jí)、II級(jí)和III級(jí)，這些都是為了滿足不同的研究和生物安全需求而開發(fā)的。請(qǐng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求選擇合適的產(chǎn)品。

使用層流罩

在開始之前，確保針對(duì)感目標(biāo)細(xì)胞系使用正確的培養(yǎng)基類型和培養(yǎng)補(bǔ)充劑。這些必須始終是無菌的，并且只能在罩內(nèi)打開。大多數(shù)細(xì)胞系可以使用Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)培養(yǎng)基或含10％胎牛血清（FBS）的Roswell Park Memorial Institute (RPMI)培養(yǎng)基。如果需要，可以添加2mM 谷氨酰胺和抗生素。

如何準(zhǔn)備DMEM介質(zhì)

某些內(nèi)皮細(xì)胞系需要特殊的膠原蛋白基質(zhì)才能生長(zhǎng)。這些基質(zhì)確保細(xì)胞系的附著、分化和生長(zhǎng)。在開始細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)之前，重要的是對(duì)目標(biāo)胞系進(jìn)行文獻(xiàn)調(diào)查，以確保滿足任何額外的生長(zhǎng)要求，如基質(zhì)。請(qǐng)注意所用燒瓶的類型，即通氣或不通氣。如果使用非通氣/塞瓶燒瓶，請(qǐng)確保松開蓋子以進(jìn)行氣體交換。如果使用通氣燒瓶，請(qǐng)確保過濾器不會(huì)弄濕，因?yàn)檫@會(huì)影響氣體交換的效率。

如何為內(nèi)皮和上皮細(xì)胞制備1％明膠基質(zhì)

每天應(yīng)在顯微鏡下檢查細(xì)胞，以確保它們健康并按預(yù)期生長(zhǎng)。熟悉顯微鏡下健康細(xì)胞的外觀非常重要，因?yàn)檫@將使通過形態(tài)變化檢測(cè)靜止或感染的細(xì)胞更加容易。

如果出現(xiàn)以下情況，請(qǐng)丟棄細(xì)胞：

哺乳動(dòng)物細(xì)胞匯合時(shí)應(yīng)分裂/傳代，這在燒瓶中70-80％的面積被細(xì)胞覆蓋時(shí)發(fā)生。在貼壁細(xì)胞中，當(dāng)沒有可見的空間可用于細(xì)胞生長(zhǎng)時(shí)，可以在顯微鏡下觀察到匯合。對(duì)于懸浮細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞凝聚在一起時(shí)，可以注意到匯合，并且當(dāng)燒瓶旋轉(zhuǎn)時(shí)，培養(yǎng)基看起來會(huì)混濁。

重要的是，不要讓細(xì)胞過度匯合，以70-80％的匯合為最佳量，在這種情況下，接觸抑制作用開始生效，并且細(xì)胞在重新接種后需要更長(zhǎng)的恢復(fù)時(shí)間。細(xì)胞系生長(zhǎng)的速度將決定所使用的分裂比。例如，如果以高比例分裂，生長(zhǎng)緩慢的細(xì)胞系將不能很好地發(fā)揮作用。

快速生長(zhǎng)的細(xì)胞系可能需要較高的分裂比例，因?yàn)榕c生長(zhǎng)較慢的細(xì)胞系相比，它們需要更短的時(shí)間達(dá)到匯合。通常，細(xì)胞分裂的比例不應(yīng)超過1:10，因?yàn)檫@對(duì)于細(xì)胞而言太低，將是細(xì)胞無法生存。改變培養(yǎng)物的接種密度可確保細(xì)胞在特定的一天準(zhǔn)備好進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

作為通用指南，一個(gè)匯合燒瓶中的細(xì)胞：70-80％的匯合分裂比例應(yīng)為1：2，并準(zhǔn)備在1-2天進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。70-80％的匯合分裂比例應(yīng)為1：5，并準(zhǔn)備在2-4天進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。70-80％的匯合分裂比例應(yīng)為1：10，并準(zhǔn)備在4-6天進(jìn)行亞培養(yǎng)或電鍍。但這可能取決于細(xì)胞系的生長(zhǎng)速率。

* 胰蛋白酶消化可能對(duì)有些細(xì)胞有毒。它還可以誘導(dǎo)某些膜蛋白的暫時(shí)內(nèi)在化，在設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)時(shí)應(yīng)予以考慮。在這些情況下，通?？梢允褂闷渌椒ǎɡ鐪睾偷募?xì)胞刮擦或使用清潔劑）代替。

如果細(xì)胞已經(jīng)生長(zhǎng)了幾天，但匯合程度不足以分裂，則必須更換介質(zhì)以補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)并保持pH值。

對(duì)于貼壁細(xì)胞

對(duì)于懸浮細(xì)胞

傳代數(shù)是細(xì)胞經(jīng)歷的傳代培養(yǎng)的次數(shù)。應(yīng)記錄傳代數(shù)并且傳代數(shù)不應(yīng)太高。與低傳代細(xì)胞相比，傳代數(shù)大于30的細(xì)胞系更有可能獲得遺傳異常（Esquenet et al., 1997; Lin et al., 2003; O’Driscoll et al., 2006）。

P30通常被認(rèn)為是培養(yǎng)中某些細(xì)胞傳代的上限，因?yàn)檫M(jìn)一步培養(yǎng)可能會(huì)導(dǎo)致分子譜的顯著變化，限制其在體內(nèi)的應(yīng)用和可重復(fù)性（Calles et al., 2006; O’Driscoll et al., 2006; Wenger et al., 2004）。

冷凍細(xì)胞系是細(xì)胞培養(yǎng)的重要組成部分，因?yàn)楦鼡Q細(xì)胞系既昂貴又費(fèi)時(shí)，而且還可以確保如果細(xì)胞被感染，還將擁有備用庫存并可以重新開始。一旦有多余的細(xì)胞可用，最好是低傳代數(shù)以限制遺傳漂變，就應(yīng)將其冷凍為接種庫存。然后可以從接種庫存中準(zhǔn)備使用的細(xì)胞。

冷凍保存細(xì)胞的最佳和*泛使用的方法是將它們保存在帶有冷凍保護(hù)劑，例如二甲基亞砜（DMSO）的液氮中。冷凍保護(hù)劑（例如DMSO）降低了培養(yǎng)基的凝固點(diǎn)并降低了冷卻速度，從而大大降低了冰晶形成的風(fēng)險(xiǎn)，而該冰晶會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡和損壞。配置細(xì)胞凍存液需要培養(yǎng)基，血清和DMSO，按照一定比例配置。費(fèi)事費(fèi)時(shí)費(fèi)力。靶點(diǎn)科技有現(xiàn)成直接使用的Bambanker無血清細(xì)胞凍存液（貨號(hào)BB01），可以直接放到-80，無需梯度程序降溫。

冷凍細(xì)胞方案

*以盡可能高的濃度和盡可能低的傳代數(shù)冷凍培養(yǎng)的細(xì)胞。冷凍之前，請(qǐng)確保至少有90％的細(xì)胞能夠存活。始終使用無菌冷凍管保存冷凍細(xì)胞。始終使用適當(dāng)?shù)臒o菌技術(shù)，并在層流罩中工作。

安全注意事項(xiàng)：使用DMSO時(shí)應(yīng)格外小心，因其會(huì)促進(jìn)有機(jī)分子進(jìn)入組織。處理該試劑時(shí)，請(qǐng)戴手套并穿著適當(dāng)?shù)姆雷o(hù)服。按照當(dāng)?shù)胤ㄒ?guī)處理試劑。

解凍細(xì)胞對(duì)冷凍細(xì)胞的壓力*，因此與冷凍細(xì)胞應(yīng)緩慢進(jìn)行冷凍不同，解凍細(xì)胞應(yīng)盡可能快地進(jìn)行，以確保細(xì)胞的高存活率。

解凍細(xì)胞方案

細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室中最常見的污染物之一是支原體。支原體是一種缺乏細(xì)胞壁的基本細(xì)菌，被認(rèn)為是最小的自我復(fù)制生物。由于支原體的尺寸很小（大約> 1µm），因此很難檢測(cè)到，直到達(dá)到*的密度并導(dǎo)致細(xì)胞培養(yǎng)物變質(zhì)才會(huì)知道它們的存在。

許多生長(zhǎng)緩慢的支原體可以在未檢測(cè)到的培養(yǎng)物中持續(xù)存在而不會(huì)引起細(xì)胞死亡，但是，它們可以改變培養(yǎng)物中宿主細(xì)胞的行為和代謝。慢性支原體感染也可能導(dǎo)致懸浮培養(yǎng)物中細(xì)胞增殖速率降低，飽和密度降低和凝集。檢測(cè)此類支原體感染的方法是定期檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)物；熒光染色（例如Hoechst）、ELISA、PCR、免疫染色、放射自顯影或微生物測(cè)定。

應(yīng)謹(jǐn)慎使用細(xì)胞培養(yǎng)中的抗生素。連續(xù)使用抗生素會(huì)增強(qiáng)抗生素耐藥性，允許存在低水平的污染并掩蓋各種污染物。一些抗生素還可以與細(xì)胞發(fā)生交叉反應(yīng)并干擾正在研究的細(xì)胞過程。

細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室根據(jù)研究機(jī)構(gòu)和研究領(lǐng)域的不同而有很大差異。但是，所有細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室確實(shí)都具有一些的通用設(shè)備和要求，其中最重要的是保持無菌的病原體環(huán)境。以下是可在更多細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室中使用的常見設(shè)備和材料的列表。此列表并不完整，根據(jù)研究領(lǐng)域的不同可見其中的偏差。

基本設(shè)備

細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室根據(jù)研究機(jī)構(gòu)和研究領(lǐng)域的不同而有很大差異。但是，所有細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室確實(shí)都具有一些的通用設(shè)備和要求，其中最重要的是保持無菌的病原體環(huán)境。以下是可在更多細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室中使用的常見設(shè)備和材料的列表。此列表并不完整，根據(jù)研究領(lǐng)域的不同可見其中的偏差。

• 細(xì)胞培養(yǎng)罩（即層流罩或生物安全柜）
• 保溫箱（建議使用潮濕的CO2保溫箱）
• 水浴
• 離心機(jī)
• 冰箱和冰柜（–20℃）
• 細(xì)胞計(jì)數(shù)器（自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)器或血細(xì)胞計(jì)數(shù)器）
• 倒置顯微鏡
• 液氮（N2）冰箱或冷凍儲(chǔ)藏容器
• 細(xì)胞培養(yǎng)容器（例如燒瓶、培養(yǎng)皿、滾瓶、多孔板）
• 移液器
• 注射器和針頭
• 垃圾箱
• 培養(yǎng)基、血清和試劑
• 細(xì)胞